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讨论：已有大量研究证实肿瘤患者血浆中肿瘤特异性循环DNA 显著升高［9］，并且这一改变可发生在肿瘤早期。因此，检测血浆中这些抑癌基因甲基化可用于肿瘤的早期诊断。目前检测DNA 甲基化的技术中， 最常用的是基于亚硫酸氢盐修饰的MSP 技术，其结果通过扩增后采用电泳进行判断。MSP 检测过程中对标本DNA 进行提取和化学修饰，会有大量DNA 模板丢失和降解［8，10］，因此MSP 仅对含大量DNA 的肿瘤组织标本适用，而难以用于检测血浆DNA 中微量水平的抑癌基因甲基化。Fischer 等［11］曾采用两步法MSP 对肺癌血清标本进行检测，其第一次扩增产物需再进行二次扩增才有可能通过电泳检测到阳性条带， 这大大增加了实验操作的繁琐程度， 同时还会出现相互的交叉污染， 导致假阳性，所以临床上难以推广应用。因此，建立高敏感性的DNA 甲基化检测技术就显得尤为重要。本研究组既往研究结果显示， 普通MSP 和荧光定量MSP（SYBR Green I 染料）对血浆中APC 基因甲基化的最低检测限分别为1．5×104 拷贝／ mL 和 1．5×103 拷贝／ mL［12］。为了提高检测敏感性，本次研究将提取的单克隆化后的NCI-H460 细胞DNA 进行定量，以10 倍梯度稀释后投入到健康人血浆中，得到5 个不同浓度的APC 基因甲基化阳性标准品； 对标准品和待测肺癌患者血浆样本同步提取化学修饰和基因扩增后，绘制标准曲线，可以对待测标本进行准确定量。研究证实本技术的检测线性范围为1．5×102～1．5×105 拷贝／ mL， 其最低限可达 1．5 ×102 拷贝／ mL， 比杨晓菲等［13］ 报道的SYBR Green Ⅰ FQ-PCR 检测下限的7．8×104 拷贝／ mL 具有更高的敏感性。当血浆浓度高于1．5×105 拷贝／ mL 也可能在线性范围内， 但对于实际检测可能没有意义， 因为肺癌患者外周血浆难以达到这个浓度。当低于1．5×102 拷贝／ mL，如15 拷贝／ mL 的这个浓度， 由于提取过程的丢失和化学修饰的降解，随机吸取APC 甲基化阳性的模板可能达不到1 个拷贝，从而导致实时荧光定量MSP 为阴性。使用本研究建立的方法，在肿瘤组织为阳性的肺癌患者的血浆中，APC 基因启动子甲基化检出率为47．5％（19 ／ 40）；而在健康对照组的血浆中，没有检测出一例阳性， 这也证实了肿瘤患者血浆DNA 主要来源于肿瘤细胞死亡释放的结论［4］。肺癌患者血浆的甲基化检出率在不同年龄和不同性别组患者之间差异没有统计学意义，而在不同病理组织类型分组中差异有统计学意义，未分化癌组、未明确分型组和腺癌组明显高于鳞癌组，可能与肺癌类型中的恶性程度及是否容易产生转移有关。在检出的 19 例肺癌患者血浆中甲基化APC 基因中位浓度在不同年龄、性别和病理组织类型分组中差异无统计学意义。根据推算，本法可检测出肿块直径小于 1 cm（1×109 个肿瘤细胞）患者的外周血甲基化改变［12］，而CT 检查只能发现1 cm 以上的肿块，传统的X 线检查更是只能发现2 cm 以上的肿块。如此，本研究所建立的检测方法在肺癌早期诊断方面可能具有重要的应用价值。本研究建立了一种新的基于TaqMan 探针的血浆APC 基因甲基化实时荧光定量MSP 的检测技术，其检测线性范围宽，敏感性高，可以用于血浆中微量 APC 基因启动子甲基化的定量检测。对临床样本检测的结果提示该技术有助于肺癌的早期诊断。内容来自肺癌公共医学网转载请注明www.zgfa120.cn
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